自然出現(xiàn)的人促性腺激素釋放激素（GnRH）受體突變對促性腺激素基因表達和GnRH調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響
前言
人GnRH受體(hGnRHR)是促性腺細胞表面存在的7個跨膜G蛋白相耦聯(lián)的受體。在與hGnRHR結(jié)合時，下丘腦的十肽GnRH刺激垂體前葉的基因表達，合成和釋放促性腺激素-LH和FSH。，配體對hGnRHR的刺激通過磷脂酶C（PLC）的增加，引起信號發(fā)放，導(dǎo)致細胞內(nèi)外鈣源的動員，激活PKC和MAPK通路。蛋白激酶A（PKA）/cAMP通路可能也被GnRH激活。雖然通常使用GnRH經(jīng)PLC激活引起肌醇磷酸生成來評價對GnRH的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，但不清楚這個通道的激活與促性腺激素亞單位的刺激和GnRHR基因的表達是否有關(guān)?？刂苹蜣D(zhuǎn)錄的GnRH刺激確切機制也尚未確定。
因為GnRH在調(diào)節(jié)生殖功能中的重要作用，所以在特發(fā)性促性腺激素不足性腺機能減退病人篩查hGnRHR的突變。結(jié)果，鑒別出了許多與生殖功能異常相關(guān)的自然出現(xiàn)的hGnRHR基因突變。在體外，這些hGnRHR突變的功能分析表明，改變了細胞表達水平、配體結(jié)合，和/或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在部分IHH病人最早鑒別出了兩種普遍自然出現(xiàn)的hGnRHR突變，它們分別為，第一次細胞外環(huán)中在106位置上(Gln106Arg)谷氨酰胺被精氨酸取代和第三次細胞內(nèi)環(huán)中在262位置(Arg262Gln)上精氨酸被谷氨酰胺取代。這兩種hGnRHRs突變的功能分析顯示，Gln106Arg突變顯著減少了GnRH的結(jié)合，而Arg262Gln對體內(nèi)受體親和力影響很小。有趣的是，兩種突變引起類似的PLC激活，表現(xiàn)為對GnRH的細胞內(nèi)IP生成減少反應(yīng)。后來，在幾名不同表型的IHH病人發(fā)現(xiàn)，Gln106Arg和Arg262Gln突變以混合雜合性同時出現(xiàn)或結(jié)合其它hGnRHR突變存在。最近，在一名男性無睪綜合癥病人和一名女性部分IHH病人發(fā)現(xiàn)了純合Gln106Arg突變。
要更好地了解存在Gln106Arg和/或Arg262Gln突變病人的表型和基因型之間的關(guān)系，重要的是確定突變受體與GnRH結(jié)合下游的功能和IP產(chǎn)物。特別是突變受體對GnRH所產(chǎn)生的促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達反應(yīng)的影響有重要的病理學(xué)意義。此外，部分失活的hGnRHR突變-Gln106Arg和Arg262Gln，是研究GnRH調(diào)節(jié)促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的有用工具。
本研究在體外分析了Gln106Arg 和 Arg262Gln對GnRH刺激的促性腺激素亞單位和GnRHR基因啟動子激活的影響。盡管這兩種突變受體引起類似的對GnRH的IP反應(yīng)減小，但對GnRH刺激的促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達有不同的影響。因此，也研究了突變受體對其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以確定兩種突變導(dǎo)致不同效應(yīng)的機制。
材料與方法
細胞培養(yǎng)
所有培養(yǎng)試劑由Life Technologies Inc獲得。在低葡萄糖DMEM中培養(yǎng)COS-7和GH3細胞。在37℃下5% CO2的潮濕空氣中，孵化細胞。
定點誘變
使用定點誘變，將Gln106Arg 或 Arg262Gln引入Dr. Thomas Gudermann所提供的編碼野生型hGnRHR表達載體。在Gln106Arg hGnRHR突變中，使用引物對：sense, 5'-GTGGACATTACAGTCCGATGGTATGCTGGAGAG-3',和 antisense, 5'-CTCTCCAGCATACCATCGGACTGTAATGTTCCA C-3'，在hGnRHR核苷酸372位置上，Gln 密碼子 CAA 被Arg 密碼子 CGA所替代。在Arg262Gln hGnRHR突變中，使用引物對: sense, 5'-CAATATACCAAGAGCACAGCTGAAGACTCTAAAAATGACG-3',和antisense, 5'-CGTCATTTTTAGAGTCTTCAGCTGTGCTCTTGGTATATTG-3'，在hGnRHR 840位置上Arg密碼子 CGG 被 Gln 密碼子 CAG替代。使用QuikChange 定點誘變藥盒產(chǎn)生hGnRHR突變，所插入的突變由雙向測序證實。
免疫細胞化學(xué)
COS-7細胞涂于35mm的玻璃培養(yǎng)皿中，使用GenePorter轉(zhuǎn)染試劑(野生型, Gln106Arg,或Arg262Gln)，或?qū)φ毡磉_載體(pcDNA3)，進行瞬時脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。在37℃下孵育48小時后，以冰凍PBS洗滌細胞，在室溫下以新鮮的4%甲醛溶液固定30分鐘，以PBS洗滌兩次，在室溫下以PBS/1%BSA閉鎖30分鐘。在37℃下以5ug/ml抗（HA）熒光劑抗體整夜孵化細胞，并以PBS洗滌4次。使用共焦激光顯微鏡在x40油浸接物鏡下檢測細胞完整表面上的野生型和突變型hGnRHRs。
受體結(jié)合測定
COS-7細胞涂于60mm組織培養(yǎng)皿中，每hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3井3ug經(jīng)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法瞬時轉(zhuǎn)染。在37℃下孵育48小時后，以DMEM和0.1% BSA洗滌細胞，在室溫下，使用Dr. P. Michael Conn所提供的100000cpm 125I-布舍瑞林孵育90分鐘，增加非標記GnRH濃度 (10-12至10-6 M) 。以冰凍PBS洗滌兩次，以0.2 M NaOH, 0.1% SDS溶解。計算溶解的細胞蛋白含量，使用γ計數(shù)器測量放射性。根據(jù)同源競爭結(jié)合分析方法的非線性回歸計算離解常數(shù)(Kd)和最大結(jié)合率(Bmax)。每一實驗至少重復(fù)三次。
IP測定
以前已經(jīng)報告了測量總IP產(chǎn)物所應(yīng)用的方案。在6井培養(yǎng)板上，通過每hGnRHR 結(jié)構(gòu)或pcDNA3井2ug電穿孔瞬時轉(zhuǎn)染 COS-7細胞。在37℃下24小時孵育后，以1ml去纖維醇的DMEM置換培養(yǎng)基2小時，然后以含有2 µCi myo-(2-3H)纖維醇相同的1ml培養(yǎng)基替換，15分鐘后加10 mM LiCl。在37℃下孵育16小時后，以逐漸增加濃度(10-11至10-6 M)的GnRH刺激細胞45分鐘，進行時間過程研究，GnRH誘導(dǎo)的IP積聚在45分鐘時最大。在冰中以20 mM的甲酸萃取細胞兩次，以7.5 mM HEPES and 150 mM KOH將溶解物中和到pH7.5。以14,000 x g離心2分鐘后，測量溶解物中的蛋白，取上清液至Ag-X8陰離子樹脂交換柱。以5ml ddH20,然后以5ml的5mM濃度的硼砂, 60 mM甲酸鈉洗滌。以3 ml的0.9 M 甲酸銨, 0.1M 甲酸萃取IPs。使用閃爍記數(shù)器測量洗脫液中的放射活性結(jié)合，每一樣本以蛋白量修正，所有測量進行三次。每一實驗至少重復(fù)三次。
熒光素酶的測定
通過大鼠LHß基因-797/+5、FSHß基因-2000/+698，人
GSU基因-846/0，和小鼠GnRHR基因-1164/+62與熒光素酶（Puc）cDNA融合產(chǎn)生指示結(jié)構(gòu)。cAMP反應(yīng)成分（CRE）指示結(jié)構(gòu)含有4個熒光素酶上游CREs。以每井2ug的hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3，每井2ug的GSU-Luc、FSHß-Luc、LHß-Luc或GnRHR-Luc、或1ug 的CRE-Luc，每井1ug魯斯肉瘤病毒β-半乳糖苷酶載體，電穿孔瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞。然后將細胞種入6井組織培養(yǎng)板中，在37℃下孵化48小時，以逐漸增加濃度(10-11 至10-5 M)的GnRH刺激4小時（根據(jù)時間過程研究，在這個時間點上得到最大的GnRH刺激的Luc活性）。以冰凍PBS洗滌細胞兩次。以125 mM 的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和0.5% 氚核溶解細胞。在4℃下14,000 x g離心后，測量上清液Luc和ß-半乳糖苷酶活性，結(jié)果以非刺激樣本的倍數(shù)表示。所有點進行三次測定，每一試驗至少重復(fù)3次。
ERK-1磷酸化的蛋白質(zhì)印跡分析
以每井2ug的hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3，以及每井2ug的HA示蹤野生型ERK-1表達載體瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞。在37℃下孵育24小時后，在0.1% BSA穩(wěn)定的無血清培養(yǎng)基（DMEM）中孵化細胞24小時，然后以逐漸增加濃度(10-10至10-5 M)的GnRH刺激10分鐘。時間過程研究表明，GnRH引起的ERK-1磷酸化在10分鐘時達到最大。然后在冰上以含有0.1% mg/ml的苯甲基磺酰氟、30 mg/ml抑肽酶和1 mM的釩酸鈉的 RIPA 緩沖劑(1 x PBS, 1% 非離子型表面活性劑 CA-630, 0.5% 脫氧膽酸鈉, 0.1% SDS)溶解細胞，并超聲粉碎20秒。在4℃下14,000 x g離心后，測量上清液中的蛋白含量，每井40ug變性蛋白加入到12%的聚丙烯酰胺凝膠中，按照標準程序進行電泳分析。將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，在4℃下以Blotto整夜阻斷。在37℃下的Blotto中以抗p-ERK抗體孵化膜2小時，以TBS,0.05% Tween-20洗滌3x10分鐘，以TBS洗滌1x10分鐘。然后在37℃下再以與辣根過氧化物酶（HRP）共軛的單克隆第二抗體在Blotto中孵化1小時，在進行適當(dāng)?shù)南礈臁Ｔ诨瘜W(xué)發(fā)光法檢測后，將膜在膠片上曝光。在帶洗滌后，在Blotto中以抗-(HA)-HRP抗體再次復(fù)制1小時，修正轉(zhuǎn)染率和蛋白裝載。修正的結(jié)果以掃描非刺激樣本膠片的密度分析的倍數(shù)表示。每一實驗至少重復(fù)三次。
計算和統(tǒng)計分析
每組實驗數(shù)據(jù)進行非線性回歸分析，計算每研究的ED50。所有統(tǒng)計分析使用Instat3.0，并根據(jù)非參數(shù)的非配對t檢驗（P <0.05）
結(jié)果
突變的hGnRHRs細胞表面的表達
為保證突變hGnRHRs的表達，以hGnRHR結(jié)構(gòu)瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞，并以免疫細胞化學(xué)方法分析固定的完整細胞表面野生型和突變受體的表達。使用野生型hGnRHR表達載體作為陽性對照，使用pcDNA3作為陰性對照。所有hGnRHR 表達載體氨基端都有HA表位標簽，以有利于無有效抗GnRHR抗體的受體測定。在以熒光素共軛的抗-HA-抗體孵化轉(zhuǎn)染細胞后,獲得了共焦熒光顯微鏡圖像（圖1）。在以野生型hGnRHR 以及Gln106Arg、Arg262Gln突變轉(zhuǎn)染細胞的外圍檢測到了熒光，但在以pcDNA3轉(zhuǎn)染的細胞表面未發(fā)現(xiàn)熒光。所有hGnRHRs的螢光形式類似，提示了正常的細胞表達和向膜的轉(zhuǎn)運。雖然不能完全排除氨基端HA標簽的存在可能影響細胞表面的表達或與配體的結(jié)合，但未觀察到對野生型hGnRHRs的影響。
受體結(jié)合的特征
為測量GnRH結(jié)合，以每種hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3轉(zhuǎn)染COS-7細胞。為進行置換層析分析，以100,000 cpm 125I-布舍瑞林和增加濃度的非標記的GnRH孵化細胞。在同源競爭結(jié)合分析的非線性回歸后，計算野生型、Gln106Arg和Arg262Gln hGnRHR結(jié)構(gòu)的Kd和Bmax（表1）。pcDNA3與GnRH無結(jié)合，而在野生型與Arg262Gln GnRHR之間，親和力或受體數(shù)量無顯著性差異。因為Gln106Arg的結(jié)合顯著減少，所以不能準確地計算Kd和Bmax。這些結(jié)果與以前報告的突變一致。
對GnRH的反應(yīng)-IP的積聚
為證實本研究使用的hGnRHR結(jié)構(gòu)保持了部分細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活功能，測量了瞬時轉(zhuǎn)染的COS-7細胞對GnRH劑量漸增的IP生成反應(yīng)。野生型hGnRHR能夠介導(dǎo)10倍的IP積聚刺激，ED50為2.5 nM GnRH（圖2，表1）。兩種突變引起劑量-反應(yīng)曲線向右偏移，類似導(dǎo)致ED50增長約7倍，也與以前的報告一致。作為陰性對照，pcDNA3并不刺激IP生成。使用瞬時轉(zhuǎn)染的GH3細胞，這些突變也同樣導(dǎo)致類似的調(diào)節(jié)GnRH刺激IP的結(jié)果。
不同GnRHRs突變對GnRH促性腺激素亞單位基因啟動子活性的影響
GnRH刺激促性腺激素生物合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未完全闡明。尚不了解IP生成是否與促性腺激素亞單位基因表達高度相關(guān)。因此，測量表達突變hGnRHRs 的細胞中GnRH刺激促性腺激素亞單位基因表達的能力。
以hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞，Luc標記與LHß、 FSHß、
GSU啟動子以及RSV-ß-半乳糖苷酶融合。當(dāng)使用COS-7細胞做這些實驗時，甚至在野生型，都未觀察到促性腺激素亞單位或GnRHR基因啟動子活性受到GnRH的刺激。與此相反，前面說明的GH3細胞支持了促性腺激素激素亞單位和GnRHR基因啟動子對GnRH的反應(yīng)性。如上所述，在GH3和COS-7細胞，hGnRHRs突變對GnRH調(diào)節(jié)的IP生成有類似的影響，因此而驗證了兩種模型的比較。
圖3為以LHß-Luc、FSHß-Luc、GSU-Luc轉(zhuǎn)染的GH3細胞的劑量-反應(yīng)分析。在表1中匯總了每種促性腺激素亞單位和受體結(jié)構(gòu)的ED50。對LHß-Luc，Gln106Arg 和Arg262Gln兩種突變引起ED50分別增加8.8和8.1倍（即對GnRH的敏感性下降，圖3A，表1）。因此，兩種突變受體降低GnRH刺激的LHß基因啟動子活性的程度相同，其方式也與對GnRH刺激的IP生成的影響相似。
兩種突變受體降低了FSHß亞單位基因啟動子對GnRH的敏感性，與野生型比較，Gln106Arg和 Arg262Gln分別降低了14和15倍（圖3Bhe biao 1）。雖然兩種突變降低對GnRH的敏感性程度相同，但這些影響大于對GnRH刺激的IP生成和LHß基因啟動子刺激的影響。有趣的是，在這些研究中，相對于野生型受體來說，F(xiàn)SHß亞單位基因啟動子對于GnRH的敏感性約比LHß或
GSU基因啟動子大5倍。
就GSU基因啟動子來說，Gln106Arg對GnRH敏感性下降相對于野生型受體下降3.8倍，Arg262Gln下降了10.6倍（圖 3C，表1）。有趣的是，Arg262Gln突變對于GnRH介導(dǎo)GSU-Luc刺激的劑量-反應(yīng)曲線的影響大于Gln106Arg突變。兩種突變對GSU的影響，不同于對GnRH刺激IP生成和LHß、FSHß基因啟動子活性的影響。
GnRH對GnRHR基因啟動子活性的刺激
因為GnRH調(diào)節(jié)本身受體的表達，所以由于hGnRHR突變而出現(xiàn)的hGnRHR基因啟動子刺激的差異可能導(dǎo)致在體細胞表面受體數(shù)量的變化。因此，進行實驗來研究兩種hGnRHR突變是否影響對GnRH刺激的GnRHR基因表達。以hGnRHR結(jié)構(gòu)或 pcDNA3瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞，熒光素酶示蹤劑融合到小鼠GnRHR基因啟動子(GnRHR-Luc)和RSV-ß-半乳糖苷酶載體。圖3D為得到的劑量-反應(yīng)曲線，ED50列于表1。GnRHR基因啟動子對GnRH的敏感性中等程度下降，Gln106Arg下降2.2倍（即ED50增加），Arg262Gln下降3.7倍。如對GSU的不同影響一樣，兩種突變的hGnRHRs對于GnRH刺激GnRHR基因啟動子活性的劑量-反應(yīng)曲線有不同的影響。
GnRH刺激的ERK激活
Gln106Arg和Arg262Gln對促性腺激素亞單位和GnRHR基因啟動子激活的影響提示，這兩種不同的受體突變可能對GnRH激活基因表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有不同的影響。兩種突變受體對GnRH刺激IP生成的影響相同僅部分解釋了這些明顯不同的影響，提示了可能存在另外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。已經(jīng)證明GnRH刺激FRK活性，這個MAPK通路在GSU基因啟動子轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮作用，并增加LHß蛋白。因此，我們測定了Gln106Arg和Arg262Gln對GnRH刺激ERK通路的影響。
因為在我們的瞬時轉(zhuǎn)染范例中，內(nèi)源性磷酸化ERK水平掩蓋了GnRH介導(dǎo)ERK激活的影響，所以，用每種hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3，以及HA示蹤的野生型ERK-1表達載體瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞。并以漸增GnRH濃度刺激細胞，然后進行蛋白質(zhì)印印跡分析。在圖4A中表示了野生型和突變受體GnRH對ERK-1的劑量依賴性激活，以及pcDNA3陰性對照的無GnRH刺激的ERK活性。使用譜帶強度的密度分析，確定相對于總HA-ERK-1的磷酸化HA-ERK-1，并用來修正轉(zhuǎn)染率和蛋白裝載。使用這些數(shù)據(jù)生成劑量-反應(yīng)曲線（圖4B），計算每種受體結(jié)構(gòu)ERK-1激活的ED50（表1）。對于Gln106Arg，ED50是野生型的2.7倍，而Arg262Gln的ED50增加到5.1倍。因此，Gln106Arg和Arg262Gln對GnRH刺激ERK活性的ED50有不同的影響，與這些突變對GSU和GnRHR基因啟動子活性的影響方式相似。
GnRH刺激的CRE-Luc激活
已經(jīng)提出，GnRH刺激的cAMP依賴性通路可能具有調(diào)節(jié)促性腺激素亞單位基因表達和LHß水平的作用。通常使用刺激的CRE-Luc作為cAMP誘導(dǎo)的標志。為了測量CRE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，以hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3、 CRE-Luc示蹤結(jié)構(gòu)和RSV-ß-半乳糖苷酶載體瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞，以漸增濃度的GnRH刺激細胞，產(chǎn)生劑量-反應(yīng)曲線（圖5）。Gln106Arg突變的GnRH刺激活性的ED50比野生型高2.7倍，而Arg262Gln突變則高6.7倍（表1）。因此，Gln106Arg和Arg262Gln突變對GnRH刺激依賴CRE的轉(zhuǎn)錄有不同的影響，與GnRH介導(dǎo)
GSU、GnRHR基因啟動子刺激和ERK激活所觀察到的方式一致。
討論
在本研究中，我們分析了hGnRHR的Gln106Arg and Arg262Gln突變對GnRH刺激促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達的影響。此外，也研究了對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以確定兩種突變可能改變GnRH刺激促性腺激素亞單位和GnRHR基因啟動子活性的機制。
由于較高的轉(zhuǎn)染率，我們在COS-7細胞完成了結(jié)合測定和IP的分析。這種細胞系也常用于計算全細胞或膜片段的Kd和測量IP水平，描述hGnRHRs突變的特征。由于COS-7細胞對GnRH無反應(yīng)，所以后來使用GH3細胞進行實驗，測量促性腺激素亞單位基因啟動子活性。因此，我們使用GH3細胞重復(fù)了IP分析，雖然在GnRH刺激后IP積聚增長的幅度不如COS-7細胞，但兩細胞系野生型和突變受體之間的ED50差異是相同的，驗證了這些比較。
有趣的是，盡管GnRH介導(dǎo)IP生成的敏感性類似下降，但Gln106Arg和 Arg262Gln hGnRHR突變卻導(dǎo)致了促性腺激素亞單位基因?qū)nRH的顯著不同的敏感性。在檢測突變受體之前，我們首先觀察到，對于野生型hGnRHR，F(xiàn)SHß亞單位基因啟動子對GnRH刺激的敏感性高于LHß或
GSU基因啟動子。這個結(jié)果與以前關(guān)于引起FSH分泌需要的GnRH量少于LH的在體觀察相一致。此外，曾有報告，在腎包膜下移植腺垂體并給以GnRH處理的垂體切除大鼠，在LH之前FSH血漿濃度增加。野生型FSHß基因啟動子對GnRH的敏感性較高提示，F(xiàn)SHß基因?qū)τ诩毎麅?nèi)通路激活的敏感性大于LHß和GSU基因，或是存在不同的信號通路。
突變受體劑量-反應(yīng)曲線的分析顯示，Gln106Arg和Arg262Gln使FSHß亞單位基因啟動子對GnRH的敏感性減少的程度大于LHß或GSU。這可能是由于促性腺激素亞單位基因?qū)餐男盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)通路的劑量依賴性激活的下降有不同的敏感性。但是，F(xiàn)SHß基因?qū)Φ蛣┝康腉nRH有較高的敏感性，所以可以預(yù)期該基因轉(zhuǎn)錄的激活受到共同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的損害的影響較小，而非更受影響。這將支持促性腺激素亞單位基因?qū)nRH的不同反應(yīng)可能存在一條以上的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
Gln106Arg和Arg262Gln對GnRH刺激的GSU基因啟動子活性有顯著不同的影響。兩種突變都降低了GSU基因?qū)nRH的敏感性，但是Arg262Gln hGnRHR突變的ED50的變化更明顯。盡管二者對GnRH調(diào)節(jié)的IP生成影響相同，但對GSU基因活性的影響不同。與此相反，兩種突變對LHß和FSHß亞單位基因?qū)nRH敏感性的影響相似。所以，GSU基因似乎與不同于LHß或FSHß基因激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，而可能取決于不同的機制。顯然，僅測量IP產(chǎn)物不適用于確定生理活動中的突變受體功能。在本文突變受體引發(fā)的不同下游影響中，非?？赡艽嬖诮?jīng)PLC以外的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，應(yīng)更詳細地加以研究。
與對GSU基因活性的影響類似，Gln106Arg和Arg262Gln hGnRHR突變也引起GnRHR基因啟動子對GnRH敏感性的不同下降，其中僅Arg262Gln突變達到統(tǒng)計學(xué)顯著性。垂體促性腺激素細胞對GnRH的反應(yīng)與細胞表面的GnRHRs濃度直接相關(guān)，GnRHRs濃度部分受到GnRHR基因表達水平的影響。因為GnRH本身調(diào)節(jié)自己受體的表達，所以可以預(yù)期，GnRH刺激GnRHR基因啟動子激活的障礙，將不能引起GnRH脈沖引起的受體上調(diào)，貢獻于促性腺激素細胞表面GnRHRs數(shù)量的下降。反過來，進一步增加GnRH在體的抵抗。
在本研究中，我們未分析突變對細胞表面表達的可能影響。除了對劑量-反應(yīng)曲線和ED50值的影響外，Gln106Arg 和 Arg262Gln突變可能也影響這些受體的合成/降解速率，導(dǎo)致GnRHR水平的變化。這些考慮與最近報告的看法非常一致，這些研究報告某些突變GnRH受體表達水平降低，這些突變的結(jié)構(gòu)改性或是使用能透過膜的非肽類hGnRH拮抗劑可部分恢復(fù)配體的結(jié)合，刺激IP的生成。在我們的配體結(jié)合測定中，Bmax指標證實轉(zhuǎn)染細胞表達了相同量的野生型和Arg262Glu hGnRHRs。雖然因所檢測的結(jié)合受體水平很低，我們未能夠定量Glu106Arg的Bmax，但共焦顯微鏡分析指出，野生型和Glu106Arg受體細胞表面的螢光表現(xiàn)相似。盡管如此，我們目前的研究集中在Gln106Arg 和 Arg262Gln對GnRH激活單一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和基因轉(zhuǎn)錄的ED50值的影響。雖然受體數(shù)量的變化可能影響特定GnRH濃度下的絕對反應(yīng)和最大反應(yīng)，但可以預(yù)期ED50值保持不變。已經(jīng)證明，ED50與受體數(shù)量無關(guān)，而是反應(yīng)了受體對配體親和力以及受體與效應(yīng)物耦合（例如，G蛋白）的變化。特別是，曾經(jīng)證明GnRH激動劑刺激GH3細胞IP生成的潛力與GnRHR濃度無關(guān)。我們進行的野生型、Glu106Arg、Arg262Glu GnRHRs的GnRHR分析也說明，突變受體對GSU基因啟動子對GnRH的敏感性的不同影響與受體濃度無關(guān)（未報告數(shù)據(jù)）。然而，ln106Arg 和 Arg262Gln突變對受體數(shù)量或循環(huán)的影響是進一步研究的方向。
雖然野生型hGnRHR存在HA標記對細胞表面的表達或功能無影響，但我們并不能完全排除HA標記對突變受體功能的影響。在這方面，值得注意的是，我們研究中Gln106Arg和Arg262Gln對配體結(jié)合和IP產(chǎn)物的影響與以前的研究（使用無HA標記的受體）相一致。而且，如上所述，HA標記對突變受體細胞表面表達的可能影響并不影響ED50值。
為了確定Gln106Arg和Arg262Gln突變是否影響經(jīng)IP產(chǎn)物之外的其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路-GnRH刺激促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達，我們研究了GnRH對ERK磷酸化和依賴CRE轉(zhuǎn)錄的刺激。已經(jīng)提出，ERK/MAPK通路在GnHR介導(dǎo)的GSU、可能的LHß基因、FSHß基因的轉(zhuǎn)錄激活和LHß蛋白的表達中發(fā)揮作用。在原代垂體細胞培養(yǎng)和T3–1、LßT2促性腺激素細胞系中，GnRH激活ERK級聯(lián)?；A(chǔ)的和GnRH刺激的GSU基因活性似乎通過ERK通路來調(diào)節(jié)。ERK或其它MAPKs也似乎在GnRH調(diào)節(jié)LHß基因表達中發(fā)揮作用。我們的結(jié)果證實，Gln106Arg和Arg262Gln突變hGnRHRs對GnRH激活ERK通路有不同影響。兩種突變hGnRHRs降低了GnRH引起的ERK激活的敏感性，但Arg262Gln hGnRHR突變引起的ED50變化更大于Gln106Arg，與GSU和GnRHR基因啟動子對GnRH的激活反應(yīng)中所觀察到ED50變化方式相同。有趣的是，雖然GnRH調(diào)節(jié)的ERK激活出現(xiàn)在蛋白激酶C的下游，盡管本文所研究的兩種突變對GnRH調(diào)節(jié)的IP生成有相同的影響，但對GnRH引起ERK激活的影響不同。其它的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，鈣離子流和上皮生長因子受體]酪氨酸激酶，也可能作用于GnRH調(diào)節(jié)的ERK激活，并貢獻于Gln106Arg和Arg262Gln對ERK通路的不同影響。
幾項報告提出，GnRH刺激的依賴cAMP通路可能也作用于GnRH調(diào)節(jié)的促性腺激素亞單位基因。已經(jīng)證明cAMP增加原代大鼠垂體細胞培養(yǎng)中的LHß和GSU mRNA水平，細胞內(nèi)cAMP水平下降引起GnRH刺激的促性腺激素亞單位mRNA水平和促性腺激素分泌減少，提示PKA通路可能貢獻于GnRH刺激的促性腺激素亞單位基因的表達。另外，已經(jīng)證明GnRHR與LßT2 細胞內(nèi)Gs及Gq結(jié)合，GnRH刺激導(dǎo)致cAMP水平的增加。Gs通路的特異阻斷引起ERK活性下降和c-fos及 LHß蛋白的減少。我們在分析hGnRHR突變中，使用了GnRH刺激CRE-Luc作為誘導(dǎo)cAMP通路的標志。對于依賴CRE的轉(zhuǎn)錄，在GnRH刺激GSU和GnRHR基因啟動子活性時觀察到，Gln106Arg和Arg262Gln突變的影響表現(xiàn)出了類似的GnRH敏感性損失，Arg262Gln hGnRHR突變引起引起ED50的變化仍然大于Gln106Arg。因此，我們的數(shù)據(jù)提示，cAMP調(diào)節(jié)通路也是介導(dǎo)Gln106Arg和Arg262Gln不同影響的候選者。但是，應(yīng)當(dāng)注意到CRE對除cAMP/PKA以外的通路是敏感的。其中應(yīng)特別注意磷酸化和CRE結(jié)合蛋白B的激活出現(xiàn)在MARK激活的下游。可能存在幾種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過復(fù)雜的聯(lián)系系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)促性腺激素亞單位和GnRHR基因的表達。
在體外研究中使用兩種自然出現(xiàn)的常見突變，可能有助于闡明hGnRHR結(jié)構(gòu)變化是如何作用于部分失活突變病人的相當(dāng)不同表型。以前已經(jīng)在不同程度IHH病人鑒別出了Gln106Arg和Arg262Gln hGnRHR突變。最近，發(fā)現(xiàn)一名不育綜合癥男性病人為純合性Gln106Arg hGnRHR突變。此外，一名純合性Gln106Arg hGnRHR突變女性病人實現(xiàn)了自然懷孕。在所報告的男性病人中，兩種促性腺激素基礎(chǔ)水平均在正常范圍內(nèi)，對于一次注射GnHR（100ug）的反應(yīng)，促性腺激素的增長不同，LH的增長大于FSH。同樣，7天脈沖式GnRH處理僅引起LH反應(yīng)，F(xiàn)SH未增長。這些在體的反應(yīng)與我們體外觀察到的Gln106Arg突變引起FSHß基因?qū)nRH的敏感性降低程度大于LHß和GSU的結(jié)果一致。如Pitteloud et al.提出的，F(xiàn)SH對GnRH無反應(yīng)，也可能是由于這些男性病人有相對較高的循環(huán)抑制素B水平。
至今，尚未在病人觀察到純合性Arg262Gln突變。但報告了幾種存在Gln106Arg 和Arg262Gln突變的混合雜合性。雖然看到了這些混合雜合性表型的可變性，但非常可能是由于性別和其它內(nèi)分泌對生殖控制的影響，這些病人都表現(xiàn)出比相對輕微臨床表現(xiàn)的Gln106Arg純合性有嚴重的多的IHH表型。僅根據(jù)IP反應(yīng)的評價可能會對表型嚴重性差異感到奇怪，但由兩種突變的hGnRHRs對GSU的刺激表現(xiàn)出不同的GnRH敏感性下降可以得到解釋。而且，Arg262Gln 引起的GnRH對GnRHR基因表達刺激的下降程度也大于Gln106Arg。這就可以預(yù)期，與Gln106Arg純合性相比，混合雜合性的促性腺激素細胞表面GnRHR受體數(shù)量減少，將進一步形成對GnRH刺激促性腺激素細胞的復(fù)合抵抗。
總之，我們在體外分析了兩種常見的hGnRHR自然突變-Gln106Arg和Arg262Gln，對GnRH刺激促性腺激素亞單位和GnRHR基因啟動子活性的影響。盡管兩種突變受體引起對GnRH的IP下降反應(yīng)類似，但觀察到了對GnRH刺激促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達的不同影響，提示兩種突變對共同的信號通路有不同的作用，或者說，更可能對不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有顯著不同的影響。進一步的研究闡明了突變受體對GnRH刺激ERK活性和CRE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的確有不同的影響。僅測量廣泛用來估價hGnRHR突變信號發(fā)放能力的IP產(chǎn)物，顯然不適合確定相關(guān)生理活動中的突變受體的功能。對GnRH刺激的LHß、FSHß、GSU亞單位基因表達的不同影響可能解釋了某些hGnRHR突變引起IHH病人某些表型的變異。這些自然出現(xiàn)的突變是研究調(diào)節(jié)GnRH對促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達不同影響的信號通道的有效工具。
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