Thomas Eggermann1, Matthias Begemann1, Gerhard Binder2, Sabrina Spengler1

1RWTH Aachen, Institute of Human Genetics, Aachen, Germany

摘要：父母源印記基因特異表達(dá)影響出生前生長的各個方面。因此可以預(yù)測許多目前已知的以生長障礙為臨床特征的印記疾?。╥mprinting disorders，IDs)。賽爾沃-拉賽爾綜合癥（Silver-Russell syndrome，SRS)是一種重要的印記疾病，這是一種先天性疾病，以子宮內(nèi)和出生后生長受限、相對巨頭畸形、三角形面孔、不對稱并在將來不典型為特征。但是臨床譜寬闊，通常依主觀臨床診斷。僅50%的典型SRS特征的病人檢測出遺傳學(xué)和外成障礙，幾乎1/10的病人攜帶有染色體7的母性單親二體(UPD(7)mat)，38%以上的病人表現(xiàn)為11p15內(nèi)印記控制區(qū)域1的低甲基化，1%以上的病人表現(xiàn)為微觀的染色體畸變。有趣的是，~7%的11p15低甲基化攜帶者，可檢測到其它基因座的脫甲基化。臨床上，這些病人與單純11p15 低甲基化的病人沒有區(qū)別，而UPD(7)mat的病人一般表現(xiàn)出輕度表型。但是，并不能夠描述清晰的基因型-表型的關(guān)系。因此，我們提出診斷11p15低甲基化、UPD(7)mat和隱秘染色體不平衡的典型SRS表型病人的診斷程序。也可用于回憶有該疾病的輕度臨床征兆的病人。

（Orphanet Journal of Rare Diseases 2010, 5:19）

回顧

最近20年來，越來越清楚低看到基因組印記與人類疾病密切相關(guān)。父母源印記基因的特異表達(dá)涉及到出生以前生長和行為的不同方面，目前已知的許多先天性印記疾?。╥mprinting disorders，IDs)以臨床生長障礙為特征。雖然Angelman綜合癥、Prader-Willi綜合癥和Beckwith-Wiedemann綜合癥(BWS)是已經(jīng)完全確認(rèn)的IDs，但對于賽爾沃-拉塞爾綜合癥（Silver-Russell syndrome，SRS)的印記檢測還是相對較新的結(jié)果。

SRS的主要特征為嚴(yán)重子宮內(nèi)和出生后生長受限、相對巨頭畸形、典型矮小和三角臉。這種疾病還伴有第五手指先天性側(cè)彎和半發(fā)育不全（表1）的畸形特征。雖然最近提出了輔助診斷的臨床打分系統(tǒng)，但診斷的準(zhǔn)確性受到臨床醫(yī)生經(jīng)驗的影響。而且，成年SRS的臨床癥狀不如兒童期初期那樣清晰。

目前SRS的發(fā)生率尚未知，但由于特征范圍寬大而存在漏診的可能性。

SRS家族性病例以及細(xì)胞發(fā)生畸變的典型遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)，證實了SRS病因中遺傳學(xué)因素的影響。大部分SRS病例為散發(fā)的，但已經(jīng)報告了家族性病例。Duncan et al.提出，大部分家族性病例以常染色體顯性方式遺傳，具有顯著的家庭內(nèi)可變性。在8個家庭也假設(shè)存在常染色體隱性遺傳，但其中的6個家庭的臨床病歷存有疑問，但在僅有的2個家庭中就多次出現(xiàn)了11p15后成突變。

在下面，將討論目前已知的SRS后成突變。我們要指出的是突變的次序并不反映重要性，而是鑒別的年代。

染色體畸變與SRS

幾名SRS病人具有許多染色體受累的結(jié)構(gòu)畸變，但只有染色體7，11和17符合嚴(yán)格SRS診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)兩名17q24-q25病人的平衡易位，曾經(jīng)長時間討論了該染色體區(qū)域在SRS病因中的重要作用。但是，兩名病人17q斷點的特性表明二者是不一樣的。目前認(rèn)為，所報告的17q上生長激素基因簇的雜合性缺失是一種致病的多態(tài)性。

然而，過去使用低微觀分辨率妨礙了常規(guī)細(xì)胞發(fā)生學(xué)分析，因此，現(xiàn)在的陣列技術(shù)的分子學(xué)核型分析可鑒別出以前微觀分析所不能的隱秘不平衡。在這期間，兩項研究報告了攜帶<3Mb的小缺失/重復(fù)的SRS病人。關(guān)于遺傳咨詢，應(yīng)當(dāng)考慮病人父母的常規(guī)核型分析，以檢測平衡的重排。

染色體7與SRS

在幾名SRS病人，已經(jīng)鑒別出的染色體7的細(xì)胞遺傳學(xué)異常包括7p11.2p13重復(fù)和小標(biāo)記染色體。該染色體成為病因的最初證據(jù)為，~10%的SRS病人鑒別出了染色體7的母性單親二體（表1），幾乎所有這些UPD(7)mat攜帶者的微衛(wèi)星分型模式均一致性地具有三染色體自救機制。由于UPD(7)mat源自三染色體，所以可以假設(shè)三體性7鑲嵌性（trisomy 7 mosaicism）是SRS的病因。這個假設(shè)被SRS病人完全偏斜的X失活頻數(shù)的增加所確證，X失活是未在病人和/或胎盤檢測出三體性7的生物學(xué)標(biāo)志。不過，兩項研究在SRS病人的白細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中均未檢測出三體性7細(xì)胞，可能是因為三體性7鑲嵌性的致命性和所分析的細(xì)胞數(shù)量有限。

在UPD病例，隱性等位基因的純合性是異常表型的又一病因，而且，確實是首先在生長延遲的囊性纖維化病人報告了UPD，這名病人因UPD(7)mat引起純合子囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)基因突變。因此，隱性突變可能是這名UPD(7)mat病人SRS表型的病因，但是不存在常見的單親二體型部分，這個結(jié)果排除了隱性基因是直接導(dǎo)致SRS的病因。

總之，UPD(7)mat攜帶者SRS表型最可能的解釋是染色體7上印記基因失常表達(dá)。UPD(7)mat通常與生長延遲和SRS-樣特征有關(guān)，而UPD(7)pat則無關(guān)。因此，假設(shè)：染色體7上的（i）父性基因表達(dá)的減少或（ii）母性基因的過表達(dá)引起SRS。

迄今為止，對染色體7編碼因子的研究集中在了7p和7q染色體片段上面。對于7p11.2-p13候選區(qū)域，已經(jīng)報告了SRS病人的重復(fù)，這個區(qū)域含有印記基因（生長因子受體結(jié)合蛋白10/GRB10）和幾種涉及人類生長和發(fā)育的因子(IGFBP1; IGFBP3; PHKG1; EGFR; GHRHR)。在SRS，已經(jīng)排除了這些基因的病理性突變，特別是，GBR10對生長具有重要作用，因此仍然是SRS的候選者。這個假設(shè)得到了最近發(fā)表的攜帶母親遺傳的dup(7)(p11.2p12)的家庭并未包括GRB10，也無SRS特征的支持。然而，盡管進(jìn)行了廣泛的篩查研究，但在SRS病人的這個編碼區(qū)域即未檢測出點突變，也未檢測出GRB10的異常甲基化。

另一方面，也有SRS病因涉及到染色體7q31區(qū)域的證據(jù)：已經(jīng)鑒別出有UPD(7q)片段的4名生長延遲病人，在7q31中有3個印記基因(MEST/PEG1; CPA4; COPG2)和2個非編碼RNAs(MESTIT, CIT1/COPG2IT1)，但篩查研究未檢測出病理性變異體。此外，在SRS病人的MEST/PEG1基因座仍未檢測出其它印記疾病所報告的單純印記缺失。

也有報告，其它染色體UPDs引起的子宮內(nèi)生長延遲，通常與人類妊娠期胎盤鑲嵌性有關(guān)，幾項報告在SRS病人使用微衛(wèi)星分型研究了其它染色體，但并未觀察到其它的UPDs。

染色體11p15與SRS

最大的SRS的分子遺傳學(xué)亞組是11p15染色體區(qū)域后成突變和突變的病人。這個區(qū)域涉及SRS病因的最早的證據(jù)是在生長延遲病人鑒別出了母性11p15重復(fù)，6名中的4名病人，除了子宮內(nèi)生長受限和出生后生長延遲外，表現(xiàn)出SRS特征。有趣的是，與其相對的障礙-父性11p15重復(fù)與BWS有關(guān)。在BWS病人可檢測出許多遺傳與外成的變化，但50%以上為11p15的異常甲基化。因此，才在SRS病人搜索11p15后成突變，并確實在38~63%的病人發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)H19和IGF2表達(dá)的11p15內(nèi)端粒ICR1低甲基化（表2）。

11p15印記簇包括有許多印記基因，其表達(dá)受到2個不同印記控制區(qū)域(ICR1和ICR2)的調(diào)節(jié)，也分別稱為H19 DMR（分化的甲基化區(qū)域）和KvDMR1（見圖1），對于胎兒的生長至關(guān)重要。

端粒ICR1調(diào)節(jié)2個父母等位基因特異的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致H19和IGF2呈彼此相反的表達(dá)。在胚胎發(fā)育過程中，2基因在源自內(nèi)胚層和中胚層的組織中表達(dá)，競爭相同的增強子。父性表達(dá)的IGF2參與胎兒的發(fā)育和生長。雖然H19是最早鑒別出的非編碼轉(zhuǎn)錄物之一，但是它的功能仍然不清楚。敲除H19，去除全部RNA編碼序列但保留啟動子和周圍轉(zhuǎn)錄單位并不影響IGF2的印記表達(dá)。這些結(jié)果說明，RNA本身不具功能，但是在哺乳類，H19是相對高度保守的基因（人和鼠之間有77%的一致性）的事實提示了密切的功能聯(lián)系。最近的研究表明，H19功能是作為基本的小RNA前身物，在脊椎動物發(fā)育過程中參與特定mRNA轉(zhuǎn)錄后的下調(diào)。在H19下游2 kb分化的甲基化區(qū)域內(nèi)，ICR1有7個CTCF靶位點(CTCF1- CTCF7)，鋅指結(jié)合因子CTCF結(jié)合母性未甲基化的ICR1拷貝，因此形成染色質(zhì)邊界。這種CTCF結(jié)合機制阻斷了IGF2表達(dá)，促進(jìn)母性11p15拷貝H19的轉(zhuǎn)錄。

著絲粒ICR2調(diào)節(jié)CDKN1C, KCNQ1（鉀通路KQT家族成員1）和更多基因彼此相反的表達(dá)，并只在母性等位基因上甲基化。在40%的家族性BWS和5~10%的散發(fā)病例，父性的突變抑制CDKN1C基因（表1）。該基因編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(p57KIP2)，是p21CIP2Cdk抑制因子家族的一部分。兩名BWS病人CDKN1C胚層突變的功能分析證明了細(xì)胞周期抑制的降低。11p15內(nèi)另一個非編碼RNA的基因- KCNQ1OT1 (LIT1)位于KCNQ1基因的內(nèi)含子9。KCNQ1OT1由父性等位基因表達(dá)，可能抑制CDKN1C基因功能的實現(xiàn)。母性ICR2等位基因的甲基化降低(LOM)與KCNQ1OT1的表達(dá)有關(guān)。在BWS，ICR2后成突變（ICR2低甲基化）以及CDKN1C點突變引起的一個重要生理學(xué)變化是CDKN1C的表達(dá)減少。

SRS的11p15后成突變主要是端粒ICR1低甲基化（表1）。與此相反，BWS最常見的變化是~50%的病人著絲粒ICR2低甲基化，而僅在2~7%的BWS病人診斷為ICR1超甲基化。臨床上，大多ICR1低甲基化攜帶者符合SRS臨床標(biāo)準(zhǔn)，但在僅有生長延遲和不對稱的病人也已經(jīng)診斷出后成突變?？墒牵趩渭兂錾昂统錾笊L受限的病人尚未監(jiān)測到這種障礙。

最近鑒別的SRS染色體重復(fù)的病人僅限于ICR2，提示了11p15上的兩個ICRs都是這種疾病的病因，如同BWS。該結(jié)果和由BWS病人獲得的進(jìn)一步的數(shù)據(jù)，以及在小鼠的研究提示，ICR1和ICR2相互作用。

11p15低甲基化的孕后起因與SRS的多基因座異常甲基化

幾乎所有SRS病人11p15后成突變的鑲嵌分布都可能貢獻(xiàn)于孕后錯誤。臨床上，這種嵌合體反映為偏側(cè)發(fā)育不全，大部分病人均存在這種臨床表現(xiàn)。

雙生子研究數(shù)據(jù)與后成突變的嵌合體分布相一致。在SRS，觀察到了4對不一致和僅有的1對一致的單卵雙生對。這種不明確的結(jié)果與Gicquel et al.的數(shù)據(jù)相一致。他們報告了血液細(xì)胞ICR1后成突變攜帶者雙生子對的不一致，但受累的雙生子皮膚成纖維細(xì)胞中存在LOM。對于ICR2基因座也有類似的觀察，不一致的BWS雙生子對的淋巴細(xì)胞有相同外成缺陷，但在成纖維細(xì)胞或口腔粘膜中有不同的甲基化模式。最終，ICR1或ICR2后成突變的孕后起因解釋了SRS或BWS雙生子對不一致的高發(fā)生率。

確定印記標(biāo)記中的合子后缺陷的進(jìn)一步證據(jù)來源于短暫的新生兒糖尿病(TNDM)病人，以及除了甲基化缺陷外有更多母性（和父性）印記基因座LOM的SRS和BWS病人的觀察。在TNDM情況下，又有LOMs表現(xiàn)的病人表型與TNDM和僅在6q24有LOM病人稍有不同，可能是由于其它印記基因座甲基化改變所致。根據(jù)這些研究結(jié)果，Mackay et al.提出了母性低甲基化綜合癥的存在。最近，也報告了血液淋巴細(xì)胞多基因座低甲基化的BWS和SRS病人。這些病人白細(xì)胞中的父性和母性印記基因座都受累。在不一致的BWS單卵雙生子，Bliek et al.在雙生子對雙方白細(xì)胞中觀察到了類似的一個或多個基因座印記異常，但在頰粘膜DNA中，只在受累的雙生子中可檢測到后成突變。在所有的研究中，有多重低甲基化基因座的BWS或SRS病人與攜帶單純11p15后成突變病人之間的表型差異不明顯。

總結(jié)不同疾病的數(shù)據(jù)，異常甲基化鑲嵌體提示受孕后出現(xiàn)了外成錯誤，影響了印記基因座甲基化信號的保持。原生殖細(xì)胞中的甲基化模式被大部消除，特定性別的甲基化模式在成熟的男女生殖細(xì)胞中重新建立。這個過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基結(jié)合域蛋白，但是這些機制仍然在很大程度上未闡明。Howell et al.曾提出胚胎早期甲基化模式動力學(xué)復(fù)雜性的觀點以及建立和保持基因組甲基化模式的機制：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1(Dnmt1)缺乏小鼠，在卵母細(xì)胞中正常建立基因組印記，但意想不到的是合子后甲基化的喪失。要維持印記基因座的甲基化可能需要Dnmt1，并且只在胚胎早期中的單一S時相中。在Dnmt3L-/-小鼠后代首次證實了規(guī)律印記的確立：當(dāng)缺乏DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3L(Dnmt3L)時，其它因子標(biāo)記了各個特異甲基化區(qū)域(DMRs)，但對于所有基因座的適當(dāng)印記模式，所有涉及因子的聯(lián)合是必需的。

SRS和SRS-樣特征病人的診斷程序

使用11p15內(nèi)ICR1低甲基化和UPD(7)mat的鑒別，可對~50%的病人進(jìn)行SRS臨床診斷的分子學(xué)確證（圖2）。

目前所有已知UPD(7)mat的病人是染色體不分離事件的結(jié)果，在這些情況下不增加家庭中的再現(xiàn)風(fēng)險。其間，報告了幾名染色體7長臂UPD的病人。因此，檢測染色體7短臂和長臂已知印記基因座UPD(7)mat是有意義的。我們提議，使用甲基化特異的PCR方法檢測7p和7q基因座，因為這樣做不僅為診斷而檢測病人的UPD(7)mat，而且也可以檢測目前未知的染色體7上的單純印記缺陷。如果獲取陽性檢測結(jié)果，則需要微衛(wèi)星分型證實UPD(7)mat，排除前述的單純性印記缺陷和缺失。

在出生前檢測UPD的情況下，特異甲基化檢測可能受到甲基化是否完備的不確定性的妨礙，因此微衛(wèi)星分型是首選方法。

診斷程序包括MS-MLPA分析11p15基因座和染色體兩臂基因座的UPD(7)mat。MSA: 微衛(wèi)星分析; MS分析: 特異甲基化檢測)

大多數(shù)SRS病人表現(xiàn)出11p15內(nèi)ICR1低甲基化。已經(jīng)報告幾種檢測方法可用于11p15基因座的甲基化分析，甲基化特異的多重探針依賴性分析方法(MS-MLPA)的優(yōu)點是在單管中可以檢測11p15內(nèi)不同基因座的拷貝數(shù)變異和異常甲基化，因此可以鑒別11p15內(nèi)ICRs甲基化缺陷和重復(fù)，以及該區(qū)域的UPDs。但是MS-MLPA以及報告的其它檢測方法也具有局限性，例如影響探針雜交或重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換的序列變異體。此外，我們不要忘記，常規(guī)診斷依據(jù)于淋巴細(xì)胞，而且?guī)缀跛蠭CR1低甲基化的SRS病人為嵌合體。因此，我們假設(shè)，少數(shù)病人逃逸了分子學(xué)診斷，因為他們的鑲嵌性影響了血液細(xì)胞以外的組織。因此，在臨床強烈懷疑SRS而又排除了主要的后成障礙的情況下，我們建議分析另一種細(xì)胞系統(tǒng)，例如口腔上皮細(xì)胞。盡管異常甲基化的MS-MLPA模式是明確的，并且不需要再次檢測來證實，但重復(fù)/缺失和UPD要使用11p15標(biāo)記微衛(wèi)星分型或qPCR來進(jìn)行核實。當(dāng)前，對于11p15印記區(qū)域特異甲基化檢測方法是否適用于出生前尚難以估價，因為胚胎中特定基因座甲基化開始時間不確定。

最近，在~7%的病人證實了除ICR1之外的其它基因座多種低甲基化。單純ICR1低甲基化病人與多印記缺陷病人之間的臨床差異普遍不明顯。為了研究的目的，可檢測ICR1脫甲基化病人的其它印記基因座，在排除了11p15后成突變和UPD(7)mat后，分子學(xué)核型分析可有助于鑒別亞微觀的不平衡。SRS染色體不平衡的出現(xiàn)頻數(shù)的確尚不了解，但根據(jù)對這一問題的2項研究，我們估價~1%的SRS病人存在這種畸變。

通過概括常規(guī)診斷SRS病例的分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，我們證明了11p15后成突變和UPD（7）mat攜帶者并不總是表現(xiàn)為明確的SRS表型，在“SRS-樣”表型的病例也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行這兩種畸變的遺傳學(xué)檢測，例如，僅有前額突出和三角臉或不對稱臨床特征的輕微子宮內(nèi)生長受限和出生后生長延遲(>-2SD)病人。特別是，不要機械地將有“SRS-樣”表型的非IUGR病人排除在分子學(xué)檢測之外。

總之，鑒于SRS的臨床診斷的主觀性，SRS的分子學(xué)驗證特別重要。關(guān)于遺傳咨詢，ICR1低甲基化或母性UPD7的鑒別由于重新發(fā)生而有低的再現(xiàn)風(fēng)險。最初的臨床特征提示母性UPD7攜帶者的表型一般較輕，而11p15后成突變攜帶者通常表現(xiàn)出典型的SRS特征。進(jìn)一步的表型分析將有助于闡明Binder et al.所提出的SRS的分子學(xué)亞組是否對生長激素治療有不同的反應(yīng)。